【目的】 比較慢速冷凍、麥管玻璃化冷凍和尼龍網玻璃化冷凍對人類卵巢組織中卵泡形態的影響?！痉椒ā?16例人卵巢組織切成薄片隨機分配到新鮮卵巢組(A組)、麥管玻璃化冷凍組（B組）、尼龍網玻璃化冷凍組（C組）和慢速冷凍組（D組）后行組織學和電鏡檢查?！窘Y果】 A、B、C、D組中形態正常的原始卵泡比例分別為72.5%±8.4%、65.6%±12.8%、 66.1%±11.1%、48.4%±13.3%；形態正常的初級卵泡比例分別為62.0%±13.9%、58.1%±7.9%、59.0%±16.2%、37.0%±14.0%。D組中形態正常的原始卵泡比例和初級卵泡比例均明顯低于A、B、C組。B、C組形態正常的原始卵泡比例和初級卵泡比例，與A組相比無統計學差異。B、C組中形態正常的原始卵泡超微結構無明顯改變，D組中形態正常的原始卵泡超微結構存在一定程度的改變?！窘Y論】 玻璃化冷凍是人類卵巢組織較適宜的冷凍保存方法。

【關鍵詞】  卵巢組織; 慢速冷凍; 玻璃化冷凍； 卵泡

    Abstract:【Objective】 To compare the effect of slow cooling with vitrification to get a more effective procedure for human ovarian tissue cryopreservation.【Methods】 Ovarian biopsies from 16 patients were cut into ovarian pieces (OPs) of 1mm thickness which randomly distributed into fresh OPs (Group A), conventional-straw vitrificated OPs (Group B), vitrificated OPs using nylon mesh (Group C) and slow cooled OPs (Group D) treatment Groups. Histological and ultrastructural observation of OPs was performed after cryopreservation.【Results】 The proportions of morphologically normal primordial and primary follicles from Group A, Group B, Group C, and Group D were 72.5%±8.4% and 62.0%±13.9%, 65.6%±12.8% and 58.1%±7.9%, 66.1%±11.1% and 59.0%±16.2%, 48.4%±13.3% and 37.0%±14.0%, respectively. The proportions of morphologically normal primordial and primary follicles from Group D were lower than those from Group A, Group B, and Group C. The difference in proportions of morphologically normal primordial follicles among Group A, Group B, and Group C was not significant, so were the proportions of morphologically normal primary follicles. The ultrastructural studies showed that in primordial follicles considered normal at histological analysis, there are no difference among Group A, Group B, and Group C. While there were a few abnormalities in Group D.【Conclusion】 Vitrification is more favorable than slow cooling in human ovarian cryopreservation.

    Key words: ovarian tissue; slow freezing; vitrification； follicle

     隨著醫學診療技術的飛速發展，惡性腫瘤患者的生存率得到明顯提高，但是抗癌治療對卵巢功能存在一定程度的損傷，出現月經稀發、閉經、不孕和卵巢功能早衰等，對患者的生存質量和生育能力造成嚴重影響。因此，如何保存患者的卵巢功能成為迫切需要解決的問題。卵巢組織冷凍保存是一種較理想的卵巢功能保存方法。目前常用的冷凍方法是慢速冷凍。但是慢速冷凍難以*避免冰晶形成，而且需要借助精密控溫儀器，操作較復雜，從而影響慢速冷凍在卵巢組織冷凍保存中的推廣應用。玻璃化冷凍，是近年來出現的一種新的冷凍方法，操作簡便，無需精密儀器控溫［1,2］。玻璃化冷凍的關鍵是使組織細胞較好的形成“玻璃化"態，盡量減少冰晶的形成。目前主要是通過改良冷凍載物加快冷凍降溫速度來改善玻璃化冷凍效果。本研究比較慢速冷凍、尼龍網玻璃化冷凍和麥管玻璃化冷凍對人類卵巢組織中卵泡形態的影響，探討人類卵巢組織適宜的冷凍保存方法，為凍融卵巢組織在移植、體外培養等研究奠定基礎。

    1   材料與方法

    1.1   標本來源

    選取中山大學附屬第二醫院婦產科2004年6月至2005年2月間進行卵巢手術的患者16例為研究對象，年齡27～35（30.2±2.5）歲，有規律月經、無內分泌紊亂、無放化療史且半年內無激素服用史。卵巢組織冷凍保存通過醫院生殖醫學倫理委員會批準，與患者簽署知情同意書。

    1.2   實驗方法

    ①在開腹或腹腔鏡手術中活檢外觀正常的卵巢組織，在室溫保存的磷酸鹽緩沖液中迅速運送至實驗室。將卵巢皮質剪成約5 mm×2 mm×1 mm的組織片，隨機分配到新鮮卵巢組（A組）、麥管玻璃化冷凍組（B組）、尼龍網玻璃化冷凍組（C組）和慢速冷凍組（D組）。②B組：卵巢組織片浸泡在快速冷凍液中（含有5.5 mol/L乙二醇、1.0 mol/L 蔗糖、100 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液），在室溫下平衡10 min用麥管（0.25 mL）按3段式法裝管，炭粉封口后直接投入液氮中。保存48 h后采用3步法依次在含有1.0 mol/L蔗糖和100 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液、0.5 mol/L蔗糖和50 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液、0.25 mol/L蔗糖和25 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中逐步稀釋去除冷凍保護劑，每次平衡時間5 min，zui后在磷酸鹽緩沖液中沖洗2次。③C組：卵巢組織片在快速冷凍液中室溫下平衡10 min，將卵巢組織片平鋪放入尼龍網袋（長2 cm、寬2 cm、網孔直徑80 μm），將尼龍網袋直接投入液氮中。保存48 h后進行快速復溫，復溫方法同B組。④D組：卵巢組織片浸泡在慢速冷凍液中（含有1.5 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液），在0 ℃平衡30 min，裝管方法同B組，采用Oktay[3]的慢速冷凍方法保存。將麥管放入程序冷凍儀內，從0 ℃開始以2 ℃/min的速度降溫至-7 ℃，平衡10 min后進行人工植冰，再以0.3 ℃/min的速度緩慢降溫至-40 ℃，后以10 ℃/min的速度降溫至-140 ℃，zui后將麥管投入液氮中，保存48 h后進行快速復溫，以冷凍保護劑的濃度梯度逐步置換冷凍保護劑（含有1.0 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液，含有0.5 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液，含有0.25 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液），每次平衡時間5 min，zui后在磷酸鹽緩沖液中沖洗2次。

    1.3   組織學檢查

    石蠟包埋卵巢組織，以5 μm的厚度連續切片，間隔50 μm的厚度行HE染色在光鏡下閱片。單盲法觀察原始卵泡和初級卵泡的形態。按Gougeon[2]的標準觀察卵泡形態：正常的卵泡結構為卵泡和卵母細胞均呈圓形，卵母細胞核無固縮，顆粒細胞分布均勻，基底膜完整；異常的卵泡結構為卵泡結構不完整或消失，卵母細胞皺縮，卵母細胞核固縮，顆粒細胞排列紊亂。原始卵泡和初級卵泡計數以卵母細胞核作為標記，計算出每個卵巢組織片中形態正常的原始卵泡比例和初級卵泡比例。其他發育階段的卵泡數目極少，未進行統計。

    1.4   電鏡檢查

    A、B、C、D 4組中每組各選2個卵巢組織片固定在25 g/L戊二醛中，經包埋修塊后行半薄切片，甲苯胺藍染色后在光鏡下定位組織學形態正常的原始卵泡，超薄切片后經醋酸鈾及*雙重染色后在透視電鏡下觀察超微結構。

    1.5   統計學處理方法

    數據用SPSS10.0統計軟件處理，結果用均數±標準差表示，各組中形態正常的卵泡比例采用One-Way ANOVA分析，各組之間兩兩比較用LSD方法，P< 0.05認為差異有顯著性。

2   結   果

    2.1   組織學檢查

    A組共觀察到原始卵泡196個，形態正常的原始卵泡比例為72.5％±8.4％，初級卵泡41個，形態正常的初級卵泡比例為62.0％±13.9％；B組共觀察到原始卵泡233個，形態正常的原始卵泡比例為65.6％±12.8％，初級卵泡48個，形態正常的初級卵泡比例為58.1％±7.9％；C組共觀察到原始卵泡286個，形態正常的原始卵泡比例為66.1％±11.1％，初級卵泡43個，形態正常的初級卵泡比例為59.0％±16.2％；D組共觀察到原始卵泡232個，形態正常的原始卵泡比例為48.4％±13.3％，初級卵泡58個，形態正常的初級卵泡比例為37.0％±14.0％。D組形態正常的原始卵泡比例明顯低于A、B、C組(t=4.12，P < 0.01)；A、B、C 3組中形態正常的原始卵泡比例無明顯差異(t=1.32，P >0.05)。D組中形態正常的初級卵泡比例低于A、B、C組(t=2.48，P < 0.05)；A、B、C 3組中形態正常的初級卵泡比例無明顯差異(t=1.69，P >0.05；圖1.A－D）。

    2.2   電鏡檢查

    相對于A組中形態正常的原始卵泡超微結構，B、C組中組織學形態正常的原始卵泡超微結構無明顯改變，僅見卵母細胞和前顆粒細胞的細胞漿基質電子密度稍下降，個別線粒體腫脹。D組中組織學形態正常的原始卵泡超微結構存在一定程度的改變，主要見前顆粒細胞和卵母細胞的胞漿基質電子密度下降，部分線粒體和內質網腫脹，粗面內質網表面核蛋白體稀疏，卵母細胞漿內小空泡稍增多，個別前顆粒細胞膜可見微小的缺損，前顆粒細胞和卵母細胞間的微絨毛分布相對稀疏（圖2.A－D）。

    3   討   論

    3.1   慢速冷凍和玻璃化冷凍對卵泡組織學形態的影響

    張佳榮等[3]報道慢速冷凍和玻璃化冷凍對小鼠卵巢組織中原始卵泡形態的影響無明顯差異。但是本實驗中發現慢速冷凍對人類卵巢組織中原始卵泡和初級卵泡的形態影響較大，而玻璃化冷凍對原始卵泡和初級卵泡的形態影響與新鮮卵巢組織相比無明顯差異。Gandolfi等[4]報道玻璃化冷凍人類卵巢組織可以較好的保存原始卵泡和初級卵泡，Gook等[5]報道慢速冷凍人類卵巢組織對原始卵泡和初級卵泡的形態影響較大，與本實驗結果一致，提示玻璃化冷凍是人類卵巢組織較適宜的冷凍保存方法，相對優于慢速冷凍。可能是因為卵巢組織中含有多種類型細胞，對緩慢降溫的速度、人工植冰時機等要求各不相同而且差異較大，使得慢速冷凍卵巢組織后較易形成冰晶，冷凍損傷較大。而玻璃化冷凍始終保持組織細胞溶液中水分子和離子的原始分布，減少甚至避免冰晶的形成，避免不同類型細胞所需的不同的冷凍平衡要求，使得卵巢組織中原始卵泡和初級卵泡均得到有效保存。

    3.2   慢速冷凍和玻璃化冷凍對原始卵泡超微結構的影響 

    本實驗中發現玻璃化冷凍后組織學形態正常的原始卵泡超微結構無明顯改變。有學者報道小鼠卵巢組織玻璃化冷凍后原始卵泡的超微結構無明顯改變[6]，與本實驗結果相一致。提示玻璃化冷凍后組織學形態正常的原始卵泡超微結構無明顯損傷。Oktay等[7]報道慢速冷凍保存人卵巢組織，組織學形態正常的原始卵泡超微結構無明顯損傷。但是本實驗發現慢速冷凍后組織學形態正常的原始卵泡超微結構中可見線粒體、內質網腫脹，粗面內質網脫顆粒，微絨毛減少，卵母細胞漿內小空泡增多以及個別的前顆粒細胞膜不完整，提示慢速冷凍后組織學形態正常的原始卵泡超微結構存在一定的損傷，但是對原始卵泡的發育潛能是否存在影響尚需進一步研究。

    3.3   不同的冷凍載物對玻璃化冷凍保存卵巢組織效果的影響

    玻璃化冷凍的關鍵是如何使組織細胞較好的形成“玻璃化"狀態，盡量避免冰晶形成。目前主要是通過改良冷凍載物加快冷凍降溫速度來改善玻璃化冷凍效果。傳統的麥管玻璃化冷凍，冷凍降溫速度較慢，約1500 ℃/min。而采用尼龍網、銅格等冷凍載物使組織與液氮直接接觸，降溫速度達15 000 ℃/min。但是本實驗中尼龍網玻璃化冷凍和麥管玻璃化冷凍對人類卵巢組織中卵泡形態的影響無明顯差異。Isachenko等[8]報道用銅格為冷凍載物玻璃化冷凍和麥管玻璃化冷凍對人類卵巢組織中卵泡形態影響無明顯差異，與本實驗結果相一致?？赡艿脑蚴锹殉步M織片結構較致密而且組織表面積與其容量之比相對較小，使得卵巢組織內部冷熱交換的速度無明顯改善。因此，通過改良冷凍載物使卵巢組織表面與液氮直接接觸，可能并不能有效地改善玻璃化冷凍效果。尼龍網玻璃化冷凍中卵巢組織與液氮直接接觸，可能會增加卵巢組織受病原體污染的機會。但是尼龍網玻璃化冷凍，裝載卵巢組織片快速簡便，每個尼龍網袋可以裝載較多的卵巢組織片，而麥管玻璃化冷凍操作較復雜，每根麥管僅能裝載1至2個卵巢組織片。因此，尼龍網玻璃化冷凍可以在短時間內完成大量卵巢組織片的冷凍保存，具有一定的*性。

    總之，本研究結果提示玻璃化冷凍是人類卵巢組織較適宜的冷凍保存方法。尼龍網玻璃化冷凍對玻璃化冷凍效果無明顯改善作用，但是操作更簡便，較適宜大量卵巢組織的冷凍保存。

【參考文獻】
  　　OKTAY K, NEWTON H, AUBARD Y, et al. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology?[J]. Fertil Steril, 1998, 69 (1):1-7.

GOUGEON A. Dynamics of follicular growth in the human: a model from preliminary results[J]. Hum Reprod, 1986, 1 (2):81-87.

張佳榮, 萬小平, 陳建利, 等. 卵巢組織超速冷凍的初步探討[J].中華婦產科雜志,2004,39(7): 495-496.

GANDOLFI F, PAFFONI A, PAPASSO BRAMBILLA E, et al. Efficiency of equilibrium cooling and vitrification procedures for the cryopreservation of ovarian tissue: comparative analysis between human and animal models[J]. Fertil Steril, 2006, 85(Suppl)1:1150-1156.

GOOK A, EDGAR D H, STERN C. Effect of cooling rate and dehydration regimen on the histological appearance of human ovarian cortex following cryopreservation in 1,2-propanediol[J]. Hum Reprod, 1999, 14 (8):2061-2068.

SALEHNIA M, ABBASIAN MOGHADAM E,REZAZADEH VELOJERDI M. Ultrastructure of follicles after vitrification of mouse ovarian tissue[J]. Fertil Steril, 2002, 78 (3):644-645.

OKTAY K, NUGENT D, NEWTON H, et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue[J]. Fertil Steril, 1997, 67(3):481-486.

ISACHENKO E, ISACHENKO V, RAHIMI G, et al. Cryopreservation of human ovarian tissue by direct plunging into liquid nitrogen[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2003, 108(2):186-193.